تاثیرات ممانعت کنندگی عصاره زعفران در جلوگیري از رشد سلول هاي سرطانی آدنوکارسینوم کولون

admin admin

خلاصه
مقدمه
این مقاله با هدف بررسی اثرات آنتی ژنوتوکسیک و سیتوتوکسیک زعفران به عنوان یک گیاه بومی ایران انجام
شده است .
روش کار
این مطالعه توصیفی تحلیلی آزمایشگاهی در تابستان سال 1387 در پژوهشکده بوعلی دانشگاه علوم پزشکی مشهد انجام شد .     سلول هاي انسانی سرطان آدنوکارسینوما و سلول هاي کلون در محیط کشت Dolbecco s  modified

(Egele s medium (DMEM شامل 10% FBS در شرایط استاندارد دماي 37 درجه سانتی گراد و در  انکوباتور دي اکسید کربن5% کشت داده شدند. تعداد 210 به توان 5 سلول در هر 200ul از محیط کشت به هر چاهک انتقال داده شد . اطلاعات با استفاده از آزمون تی زوجی و SPSS تجزیه و تحلیل شد . در نهایت تغییرات سلولی توسط تست MTT براي  غلظت هاي 2000 ،1200 ،800 ،400 ،200 میکروگرم بر میلی لیتر عصاره در سه رده سلولی مورد مطالعه HT125, AGS و L929 اندازه گیري شد .
نتایج
رده سلولی L929 تغییرات اندکی را در طی 24 و 48 ساعت اول در غلظتهاي سلولی 2000 و 1600 به ترتیب نشان داد. اما در طی 72 ساعت نیز تغییرات قابل توجهی از مرفولوژي را در غلظت هاي مشابه نیز نشان داد. در حالی که کاهش در سلول هاي سرطانی آدنوکارسینوما بسیار مشهود بود ولیکن در غلظتهاي 2000 جمعیت سلولی زنده تا حد 45 % کاهش پیدا کرد. نتایج معنی داري از مرفولوژي و تحلیل MTT تست براي سلولهاي HT125 مشاهده نشد .
نتیجه گیري
نتایج مطالعه حاضر موید شواهد روز افزون نقش عصاره زعفران به عنوان یک ترکیب پیشگیري کننده از سرطان به صورت اثر مهاري بر روي رشد و یا پیشرفت تومور می باشد ..

کلمات کلیدي: آدنوکارسینوما، پیشگیري از سرطان، زعفران ، سیتوتوکسیک

 

مقدمه پروین لایق و همکاران
امروزه به نقش گیاهان و ترکیبات طبیعی در پیشگیري از بسیاري از بیماری ها شامل سرطان توجه بسیاري می شود. با توجه به اینکه   80 % زعفران تولیدي دنیا در ایران بخصوص استان خراسان تولید می شود، لذا به نظر می رسد مطالعه اثرات آنتی ژنوتوکسیک و سیتوتوکسیک زعفران این منطقه از اهمیت خاصی برخوردار باشد . زعفران با نام علمی( Crocus sativus)به عنوان یکی از گیاهان طبی محسوب می شود و حاصل کشت در محیط هاي خشک و خنک می باشد. کلاله هاي قرمز رنگ آن به عنوان ادویه و در تهیه خوراکی هاي رنگی و همچنین در تهیه عطر استفاده می شود (1)همچنین زعفران به عنوان یکی از مهم ترین ترکیبات صادراتی محسوب شده که سالانه ارز زیادي به واسطه صادرات این محصول وارد چرخه اقتصاد کشورمان می شود. در سال هاي اخیر مطالعات در مدل هاي حیوانی و همچنین
کشت رده سلول هاي بدخیم سرطانی تاثیرات ضد توموري و پیشگیري کننده سرطانی زعفران و اجزاي اصلی آن را نشان داده است.   بدنه اصلی این پژوهش ها حاکی از این است که خود عصاره زعفران و احزاي اصلی تشکیل دهنده آن یا همان کارتنوئیدها داراي خاصیت پیشگیري کننده سرطان می باشند. همچنین عصاره گیاه زعفران داراي خاصیت ضد فعال کنندگی لوکمی، استئوسارکوما، فیبروسارکوما و سرطان تخمدان می باشد. همچنین جلوگیري از فعالیت سلول هاي سرطان سینه توسط دو گونه زعفران به اثبات رسیده است. سرطان کولورکتال به عنوان دومین علت مرگ و میر ناشی از سرطان در دنیا می باشد و در بسیاري از افراد داراي اتیولوژ ي ناشناخته است و از پولیپ هاي آدنوماتو نشات می گیرد (2،3).آدنوکارسینوما شامل 85% تمامی انواع سرطان دستگاه گوارشی است (4)همچنین مشخص
شده است که مصرف نیترات زیاد، سیگار یا غذاهاي شور خطر ابتلابه سرطان را افزایش می دهند. شواهد اپیدمیولوژیک نشان می دهند که رژیم هاي حاوي کالري بالا به ویژه حاوي چربی حیوانی نقش مهمی در پیشرفت سرطان کولورکتال دارند. امروزه ترکیبات زیادي به عنوان جلوگیري گننده و یا پیشگیري کننده هاي اولیه این نوع سرطان مطرح هستند که یکی از مهم ترین این ترکیبات شامل آسپرین و دیگر خانواده NSAIDS ها می باشند که گویا نقش خود را با مهار تولید پروستاگلندین ها ایفا می کنند.
(4)در دیگر کارآزمایی هاي بالینی ترکیبات حاوي اسید فولیک و با کلسیم خوراکی مشاهده شده که خطر پولیپ هاي آدنوکارسینوم و سرطان کولورکتال را کاهش می دهند . درمان با استروژن ها نیز در زنان احتمالا به دلیل تاثیر آن بر تولید و ساختار اسیدهاي صفراوي، میزان سرطان کولورکتال را کاهش می دهد.(4)فعالیت هاي ضد توموري به صورت گسترده اي در بسیاري از مدل هاي سلولی بررسی شده است. نقش آنتی اکسیدانی کارتنوئیدها در عصاره زعفران و تاثیرات وابسته به غلظت آن در مهار سلول هاي توموري مشخص شده است (4،5). در مطالعات گذشته نشان داده شده است که عصاره زعفران که در محیط آزمایشگاهی می تواند از تشکیل سلول هاي توموري و ساخت DNA و RNA سلولی به وسیله سلول هاي Hela ممانعت به عمل آورد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که
عصاره Crocus sativus  و کوروسین آن به صورت قابل ملاحظه اي رشد سلول هاي کولورکتال را بدون تاثیر گذاري بر رشد سایر سلول ها مهار می کند (6).به دنبال این مطالعه، مطالعه حاضر با هدف بررسی حساسیت سلول هاي بدخیم و خوش خیم نسبت به زعفران و تاثیرات ممانعتی عصاره زعفران بر ساخت درشت مولکول ها در سه رده سلولی شامل سلول هاي آدنوکارسینوم معده (AGS)،سلول هاي کولون در محیط آزمایشگاهی (HT125) و سلول هاي طبیعی (L929)می باشد .

روش کار
این مطالعه توصیفی تحلیلی آزمایشگاهی در تابستان سال 1387 در پژوهشکده بوعلی دانشگاه علوم پزشکی مشهد انجام شد.
سلول هاي آدنوکارسینوما (AGS)و سلول هاي کولون در محیط( DMEM) Dulbecco’s modified Eagle’s حاوی 10 % FBS تحت شرایط استاندارد و دماي 37 درجه سانتی گراد در انکوباتو خاوی 5 %دي اکسید کربن کشت داده شدند .
کلاله هاي زعفران crocus sativus کشت داده شده از شهرقائن (استان خراسان جنوبی، ایران) جمع آوري شدند و در دماي اتاق خشک شدند. شناسایی نوع گونه گیاه توسط هرباریوم دانشگاه فردوسی مشهد تایید شد. پنج گرم از عصاره کلاله crocus sativus در دماي 30 درجه و در طی 24 ساعت کوبیده و توسط دستگاه شیکر به صورت محلول درآمد. محلول حاصل سپس فیلتر شد و در آون 40درجه خشک شد. عصاره  خشک شده در آب مقطر حل شد و سپس مورد اتوکلاو قرار گرفت. در نهایت فرآورده در دماي منهاي 20درجه در غلظت هاي
200 ،400 ،800 ،1200 ،2000 میکرو گرم بر میلیلیتر نگهداری شد. رده هاي سلولی مورد مطالعه (HT125, AGS و L929)
در پلیت هاي 6 چاهکی کشت داده شدند،به طور خلاصه 5000 سلول به هر چاهک به همراه 5 سی سی از محیط کشت کامل انتقال داده شد. در نهایت میزان 2000 ،1200 ،800 ،400 ،200 میکروگرم بر میلی لیتر از عصاره اتوکلاو شده به هر چاهک اضافه گردید. در نهایت ازدیاد سلولی به صورت کمی توسط تست MTT با کمک الیزا خوان در طول موج 750 نانومتر

(Elisa plate reader MR600 micro plate A DYANA  teach) اندازه گیري شد. براي سنجش تاثیرات سیتوتوکسیکی غلظت هاي مختلف عصاره هر رده سلولی تعداد 210 به توان 5 سلول به همراه 200میکرولیتر از محیط کشت کامل به درون هر یک از چاهک هاي پلیت هاي 96 خانه اي انتقال داده شد. سپس غلظت هاي مختلف عصاره به هر چاهک انتقال داده شدو به مدت 24 ،48 ،72 ساعت انکوبه شد. بعد از گذشت این زمان تست MTT براي تعیین تاثیرات سیتوتوکسیک هر غلظت در سه رده سلولی مورد مطالعه HT125, AGS و L929 انجام شد.
تغیرات در ازدیاد سلولی و تاثیرات سیتوتوکسیکی قبل و بعد از درمان با غلظت هاي مختلف عصاره crocus sativus توسطآزمون تی زوجی مورد تحلیل قرار گرفت سطح آماره 95% به عنوان سطح معنی داري در نظر گرفته شد و کلیه تحلیل هاي آماري با کمک نرم افزار SPSS انجام شد.

نتایج
نتایج در دو قسمت بحث شد – 1 ، کیفی (تغییرات مرفولوژي در سلول هاي سرطانی و غیر سرطانی بعد از افزودن عصاره با غلظت
خاص و مقایسه آن با گروه شاهد) – 2 کمی (اندازه گیري ازدیاد سلولی در تست MTT براي غلظت هاي خاص عصاره در سه رده سلولی مورد مطالعه HT125, AGS و L929).
تغییرات مرفولوژیک پس از اضافه کردن عصاره در غلظت هاي مختلف از نظر شکل سلولی، چسبندگی به سطح،تعداد سلولی، تشکیل گرانول و انهدام سلولی سنجیده شده در مورد نتایج کیفی این مطالعه، نشان داده شد که نتایج بارزي در مرفولوژي و MTT براي رده سلولی HT125 مشاهده نشد. به علاوه در غلظت هاي مختلف و انکوباسیون هاي مختلف، عصاره زعفران تام اثري بر این رده سلولی HT125 نیز نداشت . لذا حداقل نتیجه این بود که در این غلظت ها عصاره تام زعفران بر سلول هاي TH125 بی اثر است. ولیکن در رده سلولی L929 در طی 24 و 48 ساعت اول در عصاره هاي با غلظت 2000 و 1600تغییرات اندکی نشان داده شده است. اما در طی 72 ساعت فاصله زمانی تغییرات قابل توجهی در مرفولوژي در این غلظت ها مشاهده شد. چنانچه در غلظت 2000 شکل سلول ها تغییر فرم داده و چسبندگی به سطح و تعداد سلول ها به طور بارزي کاهش داشته است. اما در رده سلولی AGS در طی 24 ساعت تغییرات اندکی در مرفولوژي (تغییر جزئی شکل سلول) در غلظت هاي 1600 و 2000 مشاهده شد. بعد از گذشت 48 ساعت تغییرات مشابهی غلظت 1200 رخ داد در حالی که انکوباسیون 72 ساعته در غلظت هاي2000 ،1600 و 1200 تغییرات بارزي مشاهده شد . در مورد بررسی کمی، نتایج حاصل از MTT براي رده سلولی L929 در طی24 ساعت اول در غلظت 200 میکروگرم نشان داد که افزایش اندکی در تعداد
سلول ها وجود دارد در حالی که در غلظت هاي بالاتر کاهش اندکی وجود دارد تا حدي که تعداد سلول ها به نزدیک مقادیر اولیه می رسد .
در حالت کلی تغییر قابل ملاحظه اي در انکوباسیون 24 ساعته مشاهده نشد. پس از گذشت 48 ساعت افزایش اندکی در جمعیت
سلولی در غلظت هاي200 میکروگرم بر میلی لیتر عصاره مشاهده شد.به ترتیب از غلظت 200 تا 400،400 تا 1200 و 1200 تا 2000 به
ترتیب میزان 90%،80%و75%کاهش در جمعیت سلولی زنده اتفاق افتاد. بعد از گذشت 72 ساعت درصد سلول هاي زنده کاهش بارزتري
را نشان داد. درصد سلول هاي زنده L929 میزان 80 %کاهش را در غلظت هاي 800 تا 1200 نشان داد در حالی که این میزان در غلظت
2000 میکروگرم به 60 %کاهش پیدا کرده بود.جمعیت سلول هاي AGS پس از گذشت 24 ساعت اول کاهش اندکی پیدا کرده بود ولی سپس در غلظت 200 به بالا درصد سلول هاي زنده به 80 تا 90% افزایش یافت. در طی 42 ساعت انکوباسیون تعداد سلول هاي AGS میزان80 % در غلظت 1200کاهش یافت درحالی که با افزایش در غلظت عصاره تا میزان 2000 میکروگرم بر میلی لیتر کاهش60% در  جمعیت سلول هاي زنده مشاهده شد. در طی گذشت 72 ساعت، کاهش در جمعیت سلولی AGS قابل ملاحظه تر بود در حالی که در غلظت هاي 2000 جمعیت سلولی زنده به میزان 45 % کاهش پیدا کرده بود.

بحث
به صورت استفاده از ترکیبات 1 اثرات پیشگیري کننده شیمیایی طبیعی یا مواد سنتزي در پیشگري با قطع پیشرفت سرطان در جمعیت انسانی اطلاق می شود که امروزه در مبحث پیشگیري از سرطان به آن نگاه دوباره اي شده است. همچنین مکانیسم بیوشیمی مولکولی مهار تومورها و تومورزایی نیز از موضوعات مورد توجه پژوهشی محققان است. ایجاد سرطان به عوامل مختلفی بستگی دارد که از این میان می توان از شیوه زندگی فرد،محیط و ژنتیک به عنوان سه فاکتور مهم که هر یک به تنهایی و یا در ترکیب با همدیگر در ایجاد سرطان نقش دارند یاد کرد (7). ازآنجایی که سرطان ها به عنوان یکی از مهم ترین عوامل مرگ و میر در دنیا مجسوب می شوند لذا سهولت استفاده از ترکیبات طبیعی، سبزیجات و گیاهان در پیشگیري از سرطان نگاه هاي محققان را به سمت خود جلب نموده است. مواد شیمیایی
متعددي در کنار عصاره هاي افزودنی به عنوان کارسینوژن مطرح هستند. گرچه موتاژن ها و غذاهاي سرطان زا یا رژیم هاي فقیر غذایی شامل رژیم هاي داراي فیبر کم اما غنی از چربی و کالري در افزایش شیوع سرطان هاي مختلفی موثر بوده اند، اما مکانیسم
دقیق آن به صورت کامل مشخص نشده است. بدنه اصلی شواهد نشان می دهد که کارتنوئیدها به عنوان ترکیبات ضد سرطان ، ضد
موتاژن و ایمونومدلاتور در محیط هاي برون تنی و درون تنی مطرح هستند (8).مهم ترین فاکتورهاي شیمیایی که از ایجاد سرطان جلوگیري می کند شامل آنتی اکسیدان ها، اشکال رادیکال هاي آزاد، ویتامین C ،ویتامین E و A ، مهارکننده هاي پروتئاز، رتنوئیدها و فلاونوئیدها   می باشند. بیشتر این عوامل مهاري تاثیرات خود را به واسطه فعالیتشان در مراحل پیشرفته سرطان دارند در حالی که تعدادي از آنها نیز تاثیرات مهاري خود را در مراحل اولیه سرطان زایی ایفا می کنند (9).مهمترین مکانیسم که به عنوان مهار شیمیایی مواد سرطان زا مطرح هست تاثیر مهاري بر سلول هاي توموري می باشد که ازدیاد و تکثیر آنها را مهار کند و به دنبال آن پیشرفت سلول هاي جهش یافته را مهار
کند (9).ترکیبات شاخص زعفران شامل آلفاکروسین، کارتنوئیهاي محلول در آب، پیکروکروسین و سافرانال می باشند.
یکی از مهم ترین و قوي ترین تاثیرات بیوشیمیایی زعفران اثر مهاري آن در سنتز DNA و RNA می باشد در حالیکه هیچگونه تاثیري بر سنتز پروتئین سلولی ندارد ( 10)در حالت کلی یافته ها نشان می دهد که تاثیرات مهاري زعفران در سنتز نوکلئیک اسیدها یک پایه بیوشیمیایی براي اثرات مهاري آن بر تکثیر سلول هاي توموري ایفا می کند. به منظور درك اینکه آیا مهار سنتز اسیدهاي نوکلوئیک یکی از تاثیرات مستقیم عصاره زعفران است یا در نتیجه تاثیرات متعدد اولیه دیگري بر روس سلول ها است، این حقیقت مورد مطالعه قرار گرفت به صورتی که اثر زعفران بر سنتز DNA و RNA در محیط خارج سلولی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که عصاره زعفران هیچگونه تاثیري را بر سنتز DNA و RNA در هسته سلول هاي جدا شده نداشته ، لذا بر این نکته تاکید شد که عصاره زعفران هیچگونه تاثیر مستقیمی را بر واکنش هاي سنتزي ندارد (9،10 )از سویی دیگر، رشد سلولی و تکثیر نمونه نقش وسیع و گسترده اي است که سیستم ژنتیکی DNA در بسیاري از روندهاي حیاتی ایفا می کند.و همکاران، اثرات ضد توموري زعفران در 1 با توجه به مطالعه نیر هنگامی مشاهده شد که تجویز دارو به صورت خوراکی صورت گرفت اما در موارد اینتراپریتونئال این تاثیر به دست نیامد. بنابراین نطریه پیشنهادي بیان می کند که متابولیسم اولیه اجزاي فعال می تواند به عنوان فعالیت ضد توموري لازم باشد. همچنین ششپی نهاد شده است که یکی از اجزاي زعفران به نام کروسین می تواند تاثیرات ضد توموري را ایفا کند گرچه متابولیسم معکوسی با رتنوئیدها دارد (11).دومین مکانیسم پیشنهادي براي
تاثیرات ضد توموري کارتنوئیدها بر اساس فرضیه مورد قبول استوار است که بیان می کند بعضی از اجزاي ساختاري می توانند واکنش هاي حلقه رادیکال هاي آزاد را مهار کنند. بیشتر کارتنوئیدها محلول در چربی هستند بنابراین انتظار می رود که آنها به عنوان اجزاي پاك کننده در همکاري فعال با غشا براي رادیکال هاي آزاد مطرح شوند (12).اثر کارتنوئیدها به عنوان یک نیروي بالقوه در حصار رادیکال هاي آزاد به روش اثبات شده مدل سازي مولکولی است. مکانیسم سوم بر اساس بر هم کنش بین کارتنوئیدها و یک آنزیم که مسئول پاسخ DNA سلولی است و توپی ایزومراز 2 نامیده می شود مخصوصا که مهار استخراجی اثر مستقیم بر ساخت DNA نیست ، بر اثر متابولیتیک ها ایجاد
می شود. مکانیسم پیشنهادي چهارم این است که عصاره زعفران اثرش را از طریق آپوپتوز سلولی اعمال می کند که یک نوع برنامه ریزي شده مرگ سلولی است. حلالیت کارتنوئیدها در آب  علت قدرت آنها می باشد. زعفران حل شده در آب کروسین نامیده می شود که این خصوصیت را به علت ساختار گلوکوساید دارد. این پدیده علاوه بر دارا بودن اثر مهار کنندگی بر سلول هاي توموري، کارایی زعفران ر ا در معالجه سرطان ارزیابی می کند. مطالعات دیگر نیز نشان دادند که فعالیت مهار کنندگی در استخراج کامل زعفران بیشتر به علت کروسین می باشد. مخصوصا که عناصر تشکیل دهنده کروسین سیتوتوکسیسته خیلی کمی را دارا هستند. گرچه فرضیات متنوعی ارائه شده اند اما هنوز مکانیسم واقعی زعفران و عناصرش – ضد سایتو ژنی و ضد توموري – واضح مشخص نیست. در مطالعه حاضر که در پژوهشکده بوعلی انجام گرفت ثابت شد که در آزمایشگاه و بر رده سلول هاي آدنوکارسینوم تا غلظت هاي زیرm/µg 2000 عصاره تام زعفران تاثیر دارد. عصاره تام زعفران همان اثر را بر سلول هاي طبیعی داشت در حالیکه افزایش رشد سلولی به تنهایی تا 200m/µg مشاهده شد
از طرفی دیگر در رده سلول های  آدنوکارسینوم کولون این عصاره اثری را تا غلظت 2000m/µg  نداشت. با در نظر گرفتن این نتایج باید توجه داشت که 1) عصاره تام زعفران در این مطالعه در حالی به کار رفت که زعفران داراي عناصر فراوانی است بنابراین مطالعات بیشتري
نیازمند این است که جز یئ ساختاري در زعفران یافت شود که نقش اساسی در این فرآیند داشته باشد  2) .با توجه به مطالعه بر
رده سلولی سرطان کولون (HT125) ، و تکرار سه بار تست با در نظر گرفتن طبیعت سلول هاي روده بزرگ، لذا غلظت هاي پروین لایق و همکارانبالاتر از ml/µg 2000 باید مد نظر قرار گیرند  3) .این مطالعه در محیط کشت سلولی و در آزمایشگاه ( برون تنی ) انجام گرفت،
براي عمومیت دادن نتایج به انسان، عناصر اساسی باید به طور کامل بر حیوانات آزمایشگاهی در مطالعات مشابه بررسی شوند .

نتیجه گیري
نتایج این مطالعه دلالت بر این دارد که عصاره زعفران ممکن است به صورت طبیعی بر روي رشد یا پیشرفت تومور اثر مهاري داشته باشد    و شاید بتواند در شیمی پیشگیري از سرطان نقشی ایفا کند که نیاز به مطالعات بیشتري در این زمینه می باشد .
تشکر قدردانی
نویسندگان از پرسنل پژوهشکده بوعلی به خاطر کمک هاي بی دریغشان در فرآیند آنالیزهاي آزمایشگاهی تقدیر می کنند.
همچنین از معاونت  محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی مشهد براي حمایت مالی این تحقیق قدردانی می شود.

 

 

نویسندگان:

احمد خسروي

2رضا فرید حسینی

فرحزاد جباري آزاد

4حدیث یوسف زاده

تکتم مقیمان

6محمد واعظ طبسی

7جلیل توکل افشاري

1                    -دانشیار گروه داخلی، دانشگاه علوم پزشکیمشهد، مشهد، ایران

2                    -استاد بیماري هاي ریه ،مرکز تحقیقات آلرژي ،دانشگاه علوم پزشکی مشهد، مشهد، ایران

3                    – دانشیار آلرژي و ایمونولوژي بالینی ، دانشگاهعلوم پزشکی مشهد، مشهد، ایران

4                    -دانشجوي دوره دکتري پژوهشی ایمونولوژي ،دانشگاه علوم پزشکی مشهد، مشهد، ایران

5،6 – پزشک عمومی، دانشگاه علوم پزشکیمشهد، مشهد، ایران

-استاد ایمونولوژي ،مرکز تحقیقات ایمونولوژي ،دانشگاه علوم پزشکی مشهد، مشهد، ایران

 

*مشهد- بیمارستان قائم، بخش آلرژي وایمونولوژي بالینی، مشهد، ایران  تلفن: 8400001-511-98+

دسته بندی بلاگ
اشتراک گذاری

نوشته های مرتبط

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

پرداخت آنلاین

عضویت در خبرنامه

با عضویت در خبرنامه از آخرین پیشنهادها و تخفیف های ما زودتر از بقیه با خبر شوید!
سبد خرید

هیچ محصولی در سبد خرید نیست.

ورود به سایت